肌酸激酶（Creatine Kinase, CK）活性测定说明书
（微板法 48 样 有效期：3 个月）
一、指标介绍：
肌酸激酶（ CK，EC 2.7.3.2） 主要存在于心脏 、肌肉及脑等组织中， 能可逆地催化肌酸与 ATP 之间的转磷酰基反应，在能量运转 、肌肉收缩和 ATP 再生中有重要作用。
肌酸激酶（CK）催化三磷酸腺苷和肌酸生成磷酸肌酸，后者很快全部水解为磷酸，但是三磷酸腺苷和生成的二磷酸腺苷仍很稳定；通过定磷试剂来测定磷酸肌酸水解出的磷酸含量检测 CK 酶活性大小。
二、试剂盒的组成和配制：
【注】 ：全程操作需无磷环境；试剂配置最好用新枪头和玻璃移液器等，避免磷污染。
三、实验器材：
研钵（匀浆机） 、冰盒（制冰机） 、 台式离心机 、可调式移液枪 、水浴锅（烘箱 、培养箱 、金属浴）、 96 孔板 、 离心管 、酶标仪 、蒸馏水（去离子水 、超纯水均可）。
四、指标测定：
建议先选取 1-3 个差异大的样本（例如不同类型或分组）进行预实验，熟悉操作流程，根据预实验结果确定或调整样本浓度，以防造成样本或试剂不必要的浪费！
1 、样本提取：
① 组织样本：称取约 0. 1g 组织，加入 1mL 提取液，进行冰浴匀浆 。 4℃×12000rpm 离心 10min，取上清， 置冰上待测。
【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1 ：5~ 10 的比例进行提取。
② 细菌/细胞样本：
先收集细菌或细胞到离心管内， 离心后弃上清；取约 500 万细菌或细胞加入 1mL
提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；12000rpm 4℃离心 10min，取上清， 置冰上待测。
【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（104 ）：提取液（mL）为 500~ 1000：1 的比例进行提取。
③ 液体样本 ：直接检测；若浑浊， 离心后取上清检测。
2 、检测步骤：
① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 700nm，所有试剂解冻至室温（ 25℃) 。
② 试剂一和二和三可按照 20:20:210 预先配成混合液（现配现用） ；在 EP 管中依次加入：
③ 显色反应，在 EP 管中直接加入：
【注】1.若△A 低于 0.01 可增加②歩中样本加样体积 V1(如增至 100μL ，则试剂三 相应减少，总反应体系不变) ，或延长 37℃ 孵育时间 T（如增至 60min）；或增加取样质量 W；则改变后的 V1 和 T 和 W 需代入公式计算。
2.若 A 大于 1.2 ，可用蒸馏水对③歩中上清液稀释，则稀释倍数 D 代入公式计算。
五、结果计算：
1 、标准曲线方程：y = 0.4957x - 0.0138，x 是标准品摩尔浓度 ( μmol/mL） , y 是△A。
2 、按蛋白浓度计算：
定义：每小时每毫克组织蛋白产生 1μmol 磷酸肌酸的量为一个酶活力单位。
酶活力(μmol/h/mg prot)=[(△A+0.0138)÷0.4957×V2] ÷(V1×Cpr)÷T=27.44×(△A+0.0138)÷Cpr
3 、按样本鲜重计算：
定义：每小时每克组织产生 1μmol 磷酸肌酸的量为一个酶活力单位。
酶活力(μmol/h/g 鲜重)=[(△A+0.0138)÷0.4957×V2]÷(W×V1÷V)÷T=27.44×(△A+0.0138)÷W
4 、按细菌或细胞密度计算：
定义：每小时每 1 万个细菌或细胞产生 1μmol 磷酸肌酸的量为一个酶活力单位。
酶活力(μmol/h /104 cell)=[(△A+0.0138)÷0.4957×V2]÷(500×V1÷V)÷T=0.055×(△A+0.0138)
5 、按液体体积计算：
定义：每小时每毫升液体产生 1μmol 磷酸肌酸的量为一个酶活力单位。
酶活力(μmol/h/mL)=[(△A+0.0138)÷0.4957×V2]÷V1÷T=27.44×(△A+0.0138)
V---加入提取液体积， 1mL； V1---加入样本体积，0.05mL ； W---样本鲜重，g；
V2---酶促反应总体积，0.34mL； T---反应时间， 1/2 小时； 500---细菌或细胞总数，500 万；
Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。
（微板法 48 样 有效期：3 个月）
一、指标介绍：
肌酸激酶（ CK，EC 2.7.3.2） 主要存在于心脏 、肌肉及脑等组织中， 能可逆地催化肌酸与 ATP 之间的转磷酰基反应，在能量运转 、肌肉收缩和 ATP 再生中有重要作用。
肌酸激酶（CK）催化三磷酸腺苷和肌酸生成磷酸肌酸，后者很快全部水解为磷酸，但是三磷酸腺苷和生成的二磷酸腺苷仍很稳定；通过定磷试剂来测定磷酸肌酸水解出的磷酸含量检测 CK 酶活性大小。
二、试剂盒的组成和配制：
| 试剂组分 | 试剂规格 | 存放温度 | 注意事项 |
| 提取液 | 提取液 60mL×1 瓶 | 4℃保存 | |
| 试剂一 |
粉体 1 瓶 |
4℃保存 |
1. 开盖前注意使粉体落入底部（可手动甩一甩）； 2. 加入 2.2mL 蒸馏水溶解（可超声溶解）； 3. 保存周期与试剂盒有效期相同。 |
| 试剂二 |
粉体 1 瓶 |
-20℃保存 |
1. 开盖前注意使粉体落入底部（可手动甩一甩）； 2. 加入 2.2mL 蒸馏水溶解（可超声溶解）； 3. 保存周期与试剂盒有效期相同。 |
| 试剂三 | 液体 22mL×1 瓶 | 4℃保存 | |
| 试剂四 | 液体 5mL×1 瓶 | 4℃保存 | |
| 试剂五 |
A:粉体 2 瓶 B:液体 6mL×1 瓶 |
4℃避光保存 |
每瓶： 1. 临用前在一瓶试剂A 中加2.86mL 的B液，再加 22. 14mL 的蒸馏水，混匀溶解备用； 2. 需避光，现配现用，变蓝色不能使用。 |
| 标准品 |
粉体 1 支 |
4℃避光保存 |
1. 若重新做标曲，则用到该试剂； 2. 按照说明书中标曲制作步骤进行配制； 3. 溶解后的标品一周内用完。 |
三、实验器材：
研钵（匀浆机） 、冰盒（制冰机） 、 台式离心机 、可调式移液枪 、水浴锅（烘箱 、培养箱 、金属浴）、 96 孔板 、 离心管 、酶标仪 、蒸馏水（去离子水 、超纯水均可）。
四、指标测定：
建议先选取 1-3 个差异大的样本（例如不同类型或分组）进行预实验，熟悉操作流程，根据预实验结果确定或调整样本浓度，以防造成样本或试剂不必要的浪费！
1 、样本提取：
① 组织样本：称取约 0. 1g 组织，加入 1mL 提取液，进行冰浴匀浆 。 4℃×12000rpm 离心 10min，取上清， 置冰上待测。
【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1 ：5~ 10 的比例进行提取。
② 细菌/细胞样本：
先收集细菌或细胞到离心管内， 离心后弃上清；取约 500 万细菌或细胞加入 1mL
提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；12000rpm 4℃离心 10min，取上清， 置冰上待测。
【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（104 ）：提取液（mL）为 500~ 1000：1 的比例进行提取。
③ 液体样本 ：直接检测；若浑浊， 离心后取上清检测。
2 、检测步骤：
① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 700nm，所有试剂解冻至室温（ 25℃) 。
② 试剂一和二和三可按照 20:20:210 预先配成混合液（现配现用） ；在 EP 管中依次加入：
| 试剂组分 ( μL） | 测定管 | 对照管 |
| 试剂一 | 20 | 20 |
| 试剂二 | 20 | 20 |
| 试剂三 | 210 | 210 |
| 样本 | 50 | |
| 37℃ 孵育 30min | ||
| 试剂四 | 40 | 40 |
| 样本 | 50 | |
| 混匀， 8000rpm，4℃离心 5min， 上清液待测。 | ||
| 上清液 | 100 | 100 |
| 试剂五 | 400 | 400 |
| 混匀， 室温静置 10min，若浑浊则可 8000rpm，4℃ 或室温离心 5min，取 250μL 澄清液体至 96 孔板中， 700nm 下读取各管吸光值， △A=A 测定-A 对照（每 个样本做一个自身对照）。 |
||
【注】1.若△A 低于 0.01 可增加②歩中样本加样体积 V1(如增至 100μL ，则试剂三 相应减少，总反应体系不变) ，或延长 37℃ 孵育时间 T（如增至 60min）；或增加取样质量 W；则改变后的 V1 和 T 和 W 需代入公式计算。
2.若 A 大于 1.2 ，可用蒸馏水对③歩中上清液稀释，则稀释倍数 D 代入公式计算。
五、结果计算：
1 、标准曲线方程：y = 0.4957x - 0.0138，x 是标准品摩尔浓度 ( μmol/mL） , y 是△A。
2 、按蛋白浓度计算：
定义：每小时每毫克组织蛋白产生 1μmol 磷酸肌酸的量为一个酶活力单位。
酶活力(μmol/h/mg prot)=[(△A+0.0138)÷0.4957×V2] ÷(V1×Cpr)÷T=27.44×(△A+0.0138)÷Cpr
3 、按样本鲜重计算：
定义：每小时每克组织产生 1μmol 磷酸肌酸的量为一个酶活力单位。
酶活力(μmol/h/g 鲜重)=[(△A+0.0138)÷0.4957×V2]÷(W×V1÷V)÷T=27.44×(△A+0.0138)÷W
4 、按细菌或细胞密度计算：
定义：每小时每 1 万个细菌或细胞产生 1μmol 磷酸肌酸的量为一个酶活力单位。
酶活力(μmol/h /104 cell)=[(△A+0.0138)÷0.4957×V2]÷(500×V1÷V)÷T=0.055×(△A+0.0138)
5 、按液体体积计算：
定义：每小时每毫升液体产生 1μmol 磷酸肌酸的量为一个酶活力单位。
酶活力(μmol/h/mL)=[(△A+0.0138)÷0.4957×V2]÷V1÷T=27.44×(△A+0.0138)
V---加入提取液体积， 1mL； V1---加入样本体积，0.05mL ； W---样本鲜重，g；
V2---酶促反应总体积，0.34mL； T---反应时间， 1/2 小时； 500---细菌或细胞总数，500 万；
Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。
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