明亮发光杆菌T3法——发光细菌的急性毒性试验
本方法为GB/T15441-1995的建议版本，仅供参考。如果要按照国标方法检测，请注意本渗透压调节液的为30%氯化钠，一定要用渗透压调节液配制3%氯化钠。活化液一定要用本品。
发光细菌作为毒性检测的生物学方法，因其简便、快速、灵敏且成本较低而日益受到重视。本试验项目推荐两个方法。一为国家环境保护局于1995年发布的发光细菌法（GB/T15441-1995)，采用的是海洋发光细菌菌种；二为淡水发光菌法，采用的是淡水型发光菌种。本方法适用工业废水、纳污水体及实验室条件下，可溶性化学物质的水质急性毒性监测。
1．原理
基于发光细菌相对发光度与水样毒性组分总浓度呈显著负相关（P≤0.05)，因而可通过生物发光光度计测定水样的相对发光度，以此表示其急性水平。
水质急性毒性水平可按选用相当的参比物氯化汞浓度（以mg/L为单位）来表征，或选用EC50值（半数有效浓度，以样品液百分浓度为单位）来表征。
3．仪器设备
3.1 生物发光光度计：配置2ml测试管。
3.2 2ml测试样品管，适用于相应型号的生物发光光度计。
4．试剂和材料
4.1 氯化汞HgCl2（自备），配制成：参比物氯化汞标准溶液：0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.18、0.20、0.22、0.24mg/L。
4.2 明亮发光杆菌T3小种（Photobacteriumphosphoreum T3 spp.）冻干粉（本公司产品），安瓶瓶包装，每瓶0.5g，在-20℃冰箱内有效保存期为12个月。密度不低于每克800万个细胞；当按5.3.1步骤将冻干粉复苏2min后即发光（可在暗室内检验，肉眼应见微光），稀释成工作液后每毫升菌液不低于2万个细胞（2ml测试管）。在生物发光光度计上测出的初始发光量应在600-1900mV之间。（设备可以选择瑞楚生物的生物毒性定量检测仪）
4.3 渗透压调节剂：12ml（每管添加200ul，保证可以用50个管子，2-5℃保存。）
4.4 活化液：2ml，2-5℃保存。
5.试验步骤
5.1样品液检测管和CK管配制：
样品液的稀释液一律用蒸馏水，稀释后的样品取1.8ml，加0.2ml的渗透压调节液混匀，作为检测管。同时取1.8ml蒸馏水，加0.2ml的渗透压调节液混匀，作为CK管。每个样品每个浓度可以做三个检测管和三个CK管。
5.2标准溶液管和CK管配制：建立购买氯化汞标准溶液。根据标准溶液上标注浓度用蒸馏水稀释成相应标准浓度：0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.18、0.20、0.22、0.24mg/L。同时取1.8ml蒸馏水，加0.2ml的渗透压调节液混匀，作为CK管。每个标准浓度配1个CK管
5.3发光细菌冻干菌剂复苏
5.3.1 从-20℃冰箱取出含有0.5g发光细菌冻干粉的安瓿瓶（直接置于冰上）、活化液和渗透压调节液（解冻后置于冰上），取1ml活化液注入已开口的冻干粉安瓿瓶，务必充分混匀。2min后菌即复苏发光（可在暗室内检验，肉眼应见微光）。备用。然后冷藏活化30min后备用。
5.3.2 仪器的预热和调零：打开生物发光光度计电源，预热15min，调零，备用。
5.3.3 检验复苏发光细菌冻千粉质量：另取一空2ml测试管加1.8ml蒸馏水和0.2ml渗透压调节液，加20μl活化后的菌液，盖上瓶塞，用手颠倒五次以达均匀。若发光量立即显示（或经过15min上升到）600mV以上，此瓶冻干粉可用于测试。菌液发光量先缓慢上升，约持续5-15min，后缓慢下降，约持续4h。满4h的CK发光量应不低于400mV，低于者更换冻干粉。
5.3.4 给各测试管加复苏菌液：在发光菌液复苏稳定（约30min)后，向标准溶液管、样品溶液管和相应的CK管中加入20ul复苏菌液（每管加菌液间隔时间勿短于30s。每管在加菌液的当时务必精确计时，记录到秒，即为样品与发光菌反应起始时间。立即将此时间加15min，记作各管反应终止（即应该读发光量）的时间。
5.3.5 发光细菌与样品反应达到终止时间的读数：按各管原来加菌液的先后顺序，当某管达到记录的反应终止时间，立即将测试管放入仪器测试舱，读出其发光量（以光信号转化的电信号一电压毫伏数表示）。
5.3.6 根据设备自带标准曲线功能，计算出来标准曲线（浓度和相对发光量之间的标准曲线）。然后根据样品相对发光量计算出来样品的生物毒性剂量（单位为 mg/L）。
6．质量保证与质量控制
6.1 每支发光菌的发光强度和稳定性不尽相同，同批样品测定过程中应使用同一支发光菌，如果需做氯化汞标准曲线，也应与样品使用同一支发光菌。如果一支不够用，可采用同批的两支混合后使用。
6.2 国际上一般通用反应时间为5min或15min两种，鉴于我国目前所用发光杆菌的灵敏度和稳定性，采用15min。
6.3 三次重复测定结果相对偏差确定为≤1％。
6.4 测定应在采集样品后立即进行，在6h内不能测定应低温保存，但不得超过24h。
6.5 关于样品如何稀释的问题，一般根据样品毒性大小决定，但是在试验中至少要选择六个不同浓度。如果六个浓度的相对发光度在1%-100％之外，可增配若干个浓度，使之落在1%-100％相对发光度范围内，以求相关方程。
6.6 如果样品浓度为最高极限浓度（即100%）时，其相对发光率都不能使发光强度减少50%，则对样品的EC50值只能示为＞100%。
6.7 鉴于发光细菌法实验因素的影响，实验结果具有一定误差。在评价毒物的剂量一效应关系时，应确定95％置信区间，即T=a+bC±2SE（SE为剩余标准差），以此求出的EC50也有一定的区间，可根据这些结果确定实验结果的准确性和真实性。对于实验结果的重现性，就大多数而言，一般EC50值的变异系数在6％-10%。
7.测试结果的表达
7.1 计算样品相对发光度（％），并算出平均值：
相对发光度（%)=氯化汞管或样品管发光量（mV)/CK管发光量（mV)×100
相对发光度（％）平均值＝（重复1）（%）+（重复2）（%）+（重复3）（%）/3
7.2 氯化汞浓度（C)与其相对发光度（T，％）均值具有线性相关方程，也可以绘制关系曲线。
求出一元一次线性回归方程的a（截距）、b（斜率、回归系数）和r（相关系数），列出方程：
T=a+bC氯化汞
查相关系数显著水平（P值）表，检验所求r值的显著水平。若P≤0.01，且EC50氯化汞=0.1mg/L±0.02mg/L，则所求相关方程成立；反之，不能成立，必须重测系列氯化汞浓度的发光量。氯化汞溶液配制过夜者，必须重配后再测定。
8．结果评价
8.1 用氯化汞浓度表达毒性
8.1.1适用的条件：符合条件（样品母液相对发光度＞1%）并按7.2建立了合格（(P≤0.01、EC50氯化汞=0.10mg/L±0.02mg/L）的氯化汞浓度与其相对发光度相关方程者。
8.1.2表达方法：
①将测得的样品相对发光度，代入7.2的相关方程，求出与样品急性毒性相当的氯化汞浓度（一般用mg/L）表示。
②测试结果报告同时列举样品相对发光度及其相当的氯化汞浓度值。
8.1.3 适用性：适用于相对发光度在1％以上，特别是50％以上（即不可能出现EC50值）但低于100%（即仍有中、低水平毒性）的样品毒性测定。
8.2 用EC50值表达样品毒性
8.2.1适用的条件：符合条件（样品母液相对发光度低于50％乃至零）并按7.2建立了合格（P≤0.01）的样品稀释液浓度与其相对发光度相关方程者。
8.2.2表达方法：
①将T代入7.2建立的相关方程，求出样品的EC50值。这里的EC50值以样品的稀释浓度（一般用百分浓度）表示。
②测试结果报告列举样品的EC50值。
8.2.3适用性：适用于相对发光度在50％以下，特别是零（即毒性水平较高或很高）的样品毒性测定，后者无法以相当的氯化汞浓度表达毒性。
本方法为GB/T15441-1995的建议版本，仅供参考。如果要按照国标方法检测，请注意本渗透压调节液的为30%氯化钠，一定要用渗透压调节液配制3%氯化钠。活化液一定要用本品。
发光细菌作为毒性检测的生物学方法，因其简便、快速、灵敏且成本较低而日益受到重视。本试验项目推荐两个方法。一为国家环境保护局于1995年发布的发光细菌法（GB/T15441-1995)，采用的是海洋发光细菌菌种；二为淡水发光菌法，采用的是淡水型发光菌种。本方法适用工业废水、纳污水体及实验室条件下，可溶性化学物质的水质急性毒性监测。
1．原理
基于发光细菌相对发光度与水样毒性组分总浓度呈显著负相关（P≤0.05)，因而可通过生物发光光度计测定水样的相对发光度，以此表示其急性水平。
水质急性毒性水平可按选用相当的参比物氯化汞浓度（以mg/L为单位）来表征，或选用EC50值（半数有效浓度，以样品液百分浓度为单位）来表征。
3．仪器设备
3.1 生物发光光度计：配置2ml测试管。
3.2 2ml测试样品管，适用于相应型号的生物发光光度计。
4．试剂和材料
4.1 氯化汞HgCl2（自备），配制成：参比物氯化汞标准溶液：0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.18、0.20、0.22、0.24mg/L。
4.2 明亮发光杆菌T3小种（Photobacteriumphosphoreum T3 spp.）冻干粉（本公司产品），安瓶瓶包装，每瓶0.5g，在-20℃冰箱内有效保存期为12个月。密度不低于每克800万个细胞；当按5.3.1步骤将冻干粉复苏2min后即发光（可在暗室内检验，肉眼应见微光），稀释成工作液后每毫升菌液不低于2万个细胞（2ml测试管）。在生物发光光度计上测出的初始发光量应在600-1900mV之间。（设备可以选择瑞楚生物的生物毒性定量检测仪）
4.3 渗透压调节剂：12ml（每管添加200ul，保证可以用50个管子，2-5℃保存。）
4.4 活化液：2ml，2-5℃保存。
5.试验步骤
5.1样品液检测管和CK管配制：
样品液的稀释液一律用蒸馏水，稀释后的样品取1.8ml，加0.2ml的渗透压调节液混匀，作为检测管。同时取1.8ml蒸馏水，加0.2ml的渗透压调节液混匀，作为CK管。每个样品每个浓度可以做三个检测管和三个CK管。
5.2标准溶液管和CK管配制：建立购买氯化汞标准溶液。根据标准溶液上标注浓度用蒸馏水稀释成相应标准浓度：0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.18、0.20、0.22、0.24mg/L。同时取1.8ml蒸馏水，加0.2ml的渗透压调节液混匀，作为CK管。每个标准浓度配1个CK管
5.3发光细菌冻干菌剂复苏
5.3.1 从-20℃冰箱取出含有0.5g发光细菌冻干粉的安瓿瓶（直接置于冰上）、活化液和渗透压调节液（解冻后置于冰上），取1ml活化液注入已开口的冻干粉安瓿瓶，务必充分混匀。2min后菌即复苏发光（可在暗室内检验，肉眼应见微光）。备用。然后冷藏活化30min后备用。
5.3.2 仪器的预热和调零：打开生物发光光度计电源，预热15min，调零，备用。
5.3.3 检验复苏发光细菌冻千粉质量：另取一空2ml测试管加1.8ml蒸馏水和0.2ml渗透压调节液，加20μl活化后的菌液，盖上瓶塞，用手颠倒五次以达均匀。若发光量立即显示（或经过15min上升到）600mV以上，此瓶冻干粉可用于测试。菌液发光量先缓慢上升，约持续5-15min，后缓慢下降，约持续4h。满4h的CK发光量应不低于400mV，低于者更换冻干粉。
5.3.4 给各测试管加复苏菌液：在发光菌液复苏稳定（约30min)后，向标准溶液管、样品溶液管和相应的CK管中加入20ul复苏菌液（每管加菌液间隔时间勿短于30s。每管在加菌液的当时务必精确计时，记录到秒，即为样品与发光菌反应起始时间。立即将此时间加15min，记作各管反应终止（即应该读发光量）的时间。
5.3.5 发光细菌与样品反应达到终止时间的读数：按各管原来加菌液的先后顺序，当某管达到记录的反应终止时间，立即将测试管放入仪器测试舱，读出其发光量（以光信号转化的电信号一电压毫伏数表示）。
5.3.6 根据设备自带标准曲线功能，计算出来标准曲线（浓度和相对发光量之间的标准曲线）。然后根据样品相对发光量计算出来样品的生物毒性剂量（单位为 mg/L）。
6．质量保证与质量控制
6.1 每支发光菌的发光强度和稳定性不尽相同，同批样品测定过程中应使用同一支发光菌，如果需做氯化汞标准曲线，也应与样品使用同一支发光菌。如果一支不够用，可采用同批的两支混合后使用。
6.2 国际上一般通用反应时间为5min或15min两种，鉴于我国目前所用发光杆菌的灵敏度和稳定性，采用15min。
6.3 三次重复测定结果相对偏差确定为≤1％。
6.4 测定应在采集样品后立即进行，在6h内不能测定应低温保存，但不得超过24h。
6.5 关于样品如何稀释的问题，一般根据样品毒性大小决定，但是在试验中至少要选择六个不同浓度。如果六个浓度的相对发光度在1%-100％之外，可增配若干个浓度，使之落在1%-100％相对发光度范围内，以求相关方程。
6.6 如果样品浓度为最高极限浓度（即100%）时，其相对发光率都不能使发光强度减少50%，则对样品的EC50值只能示为＞100%。
6.7 鉴于发光细菌法实验因素的影响，实验结果具有一定误差。在评价毒物的剂量一效应关系时，应确定95％置信区间，即T=a+bC±2SE（SE为剩余标准差），以此求出的EC50也有一定的区间，可根据这些结果确定实验结果的准确性和真实性。对于实验结果的重现性，就大多数而言，一般EC50值的变异系数在6％-10%。
7.测试结果的表达
7.1 计算样品相对发光度（％），并算出平均值：
相对发光度（%)=氯化汞管或样品管发光量（mV)/CK管发光量（mV)×100
相对发光度（％）平均值＝（重复1）（%）+（重复2）（%）+（重复3）（%）/3
7.2 氯化汞浓度（C)与其相对发光度（T，％）均值具有线性相关方程，也可以绘制关系曲线。
求出一元一次线性回归方程的a（截距）、b（斜率、回归系数）和r（相关系数），列出方程：
T=a+bC氯化汞
查相关系数显著水平（P值）表，检验所求r值的显著水平。若P≤0.01，且EC50氯化汞=0.1mg/L±0.02mg/L，则所求相关方程成立；反之，不能成立，必须重测系列氯化汞浓度的发光量。氯化汞溶液配制过夜者，必须重配后再测定。
8．结果评价
8.1 用氯化汞浓度表达毒性
8.1.1适用的条件：符合条件（样品母液相对发光度＞1%）并按7.2建立了合格（(P≤0.01、EC50氯化汞=0.10mg/L±0.02mg/L）的氯化汞浓度与其相对发光度相关方程者。
8.1.2表达方法：
①将测得的样品相对发光度，代入7.2的相关方程，求出与样品急性毒性相当的氯化汞浓度（一般用mg/L）表示。
②测试结果报告同时列举样品相对发光度及其相当的氯化汞浓度值。
8.1.3 适用性：适用于相对发光度在1％以上，特别是50％以上（即不可能出现EC50值）但低于100%（即仍有中、低水平毒性）的样品毒性测定。
8.2 用EC50值表达样品毒性
8.2.1适用的条件：符合条件（样品母液相对发光度低于50％乃至零）并按7.2建立了合格（P≤0.01）的样品稀释液浓度与其相对发光度相关方程者。
8.2.2表达方法：
①将T代入7.2建立的相关方程，求出样品的EC50值。这里的EC50值以样品的稀释浓度（一般用百分浓度）表示。
②测试结果报告列举样品的EC50值。
8.2.3适用性：适用于相对发光度在50％以下，特别是零（即毒性水平较高或很高）的样品毒性测定，后者无法以相当的氯化汞浓度表达毒性。
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帐 户 名 上海瑞楚生物科技有限公司
账 号 epay@ruichubio.com
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运输：
（1）生物试剂需要冷冻运输，运输需要泡沫盒和一定量的冰袋（特殊商品需要干冰），运费金额会开进发票里。运费以显示为准
（2）常规试剂采用快递，运费以显示为准。
（3）大物件一般默认发德邦物流，运费需联系客服计算。
