2×SYBR qPCR MasterMix（Universal）
 产品包装：    组成 RTQ3101-02 (可做40次50 μl反应) RTQ3101-03 (可做200次50 μl反应) RTQ3101-04 (可做1000次50 μl反应) 长期贮存 2×SYBR qPCR MasterMix 1ml 5×1ml 25×1ml -20℃ RNase-free water 1 ml 5×1 ml 25×1 ml -20℃   注：以50μl qPCR反应体系为例，每次使用25 μl 2×MasterMix，1 ml可做40次 50μl qPCR反应。
 储存条件: -20℃避光保存；经常使用时，一旦融化后请4℃贮存，4℃保存至少3个月；尽量避免反复冻融。
 产品简介： 本制品是采用SYBR® Green I嵌合荧光法进行Real Time PCR的专用试剂。已经将 Hot-Start DNA聚合酶、dNTP、特殊稳定剂、优化的反应缓冲液和 SYBR® Green I 等试剂预混成一种适合 Real Time PCR反应检测用 2×MasterMix试剂，具有灵敏度高、特异性强、稳定性好等特点。 本制品使用新型抗体修饰的 HotStart Taq DNA聚合酶，并结合精心优化的反应 Buffer，从而有效抑制低温下的非特异性扩增，提高反应特异性和扩增效率，能够在更宽广的范围内进行准确定量。使用时只需加入模板、引物和水，便可在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，对目的基因进行准确定量检测，重复性好，可信度高。 预混液中含有优化的校正染料，与一系列qPCR设备兼容，包括需要ROX校正的仪器，实验操作过程中不需要额外添加校准染料来校正仪器。
 注意事项 1. 本制品中已经含有优化的校正染料，客户无需再添加校正染料，可以直接使用。 2. 本制品含SYBR® Green I，强光下易分解，使用时避免长时间强光照射本制品。 3. 建议在冰上配制qPCR反应液，再放入qPCR仪器中扩增。可以提高扩增特异性，减少背景。 4.-20℃下保存时间较长，有微量沉淀产生，充分混匀后不影响使用。本制品已经优化了反应缓冲液中的Mg2+浓度，无需再调节Mg2+浓度。 5. 模板DNA：用本产品，cDNA、基因组DNA、质粒DNA、病毒DNA等都可作为模板。在添加DNA模板时请注意模板量对PCR扩增的影响。本产品建议添加量为：cDNA添加量不应超过总反应体系的10%；基因组DNA为模板时，为避免在高浓度区域出现线性差的情况，请注意添加量小于500 ng；病毒DNA也可作为PCR模板，添加时请以300 ng为上限；由于质粒DNA浓度和拷贝数很高，在添加PCR模板之前最好进行稀释梯度试验，以便确定合适的质粒DNA拷贝数。 6. 引物： 建议每条引物工作浓度200 nM-800 nM；为得到高灵敏度定量性的数据，引物的设计非常重要。以下列举了设计引物时需注意的一般事项。 a) 引物长度请设定为18bp～30bp、GC含量为40%～65%； b) 扩增片段一般小于300bp，请尽量设定在80bp～150bp。过长的片段容易导致扩增效率降低； c) 如设计mRNA为目的片段的引物，设计应尽量横跨内含子，以防止基因组DNA的扩增而引起假阳性； d) 请尽量选择Tm为65℃～67℃； e) A、G、C、T整体分布尽量均匀。不要有部分的GC rich或AT rich（特别是3'端）。避开T/C（Polypyrimidine）或A/G（Polypurine）的连续结构； f) 避开引物内部或两条引物之间有3个碱基以上的互补序列。二条引物间的3'末端避开有2个碱基以上的互补序列； g) 引物设计完成后要使用BLAST检索确认引物的特异性。 此外，引物的纯化纯度对反应特异性有很大的影响。经过一般纯化、纯度较低的引物荧光强度散乱，容易产生非特异性产物，致使熔解曲线出现杂峰。请尽可能使用HPLC级别纯化，至少要用经Cartridge(OPC)级别以上纯化的引物。 7. 对照设计： 1）No template control（NTC）：在qPCR反应体系中仅仅缺少模板。用以检测有无二聚体和试剂有无污染。 2）Reverse Transcripase control：用以评估逆转录反应中有无基因组DNA的污染。在逆转录反应中仅仅不含有逆转录酶。
  使用说明： 1. 冰浴中彻底融化2×qMasterMix，避免涡旋震荡，以免产生过多气泡，彻底混匀后快甩离心将溶液收集到管底。 2. 按照下表在制备反应体系：   50 μl反应体系 20 μl反应体系 终浓度 2×qPCR MasterMix 25 μl 10 μl 1× 上游引物 10 μM 1 μl 0.4 μl 0.2 μM 下游引物 10 μM 1 μl 0.4 μl 0.2 μM 模板 × μl x μl 10pg-100ng 水 补至50 μl 补至20 μl   3. 快甩离心将反应液收集到管底。 4. 检测片段大于300 bp，qPCR仪上推荐执行以下程序（三步法）： 步骤 温度 时间 循环数 初始变性 95℃ 30 sec* 1 变性 95℃ 15 sec 40 退火 55-65℃ 30 sec 延伸 72℃ 30 sec 熔解曲线 使用机器默认采集程序 检测片段小于300 bp，qPCR仪上推荐执行以下程序（两步法）： 步骤 温度 时间 循环数 初始变性 95℃ 30 sec* 1 变性 95℃ 15 sec 40 退火和延伸 60℃ 60 sec 熔解曲线 使用机器默认采集程序 注：由于本MasterMix中的Hot-start DNA聚合酶是经过抗体修饰的，初始变性95℃30 sec即可。
 实验结果分析 反应结束后加做融解曲线，以区分扩增产物及引物二聚体。根据扩增曲线和融解解曲线结果可进行PCR定量标准曲线的制作。
 常见问题及处理 问题 可能原因 推荐的解决方法 无扩增曲线且无扩增产物（凝胶电泳） 反应体系中有PCR反应抑制剂 更换或纯化模板DNA。 引物设计不合理 重新设计、合成引物。 逆转录产物体积过量 减少逆转录产物量以不超过反应体系的10%。 加样错误或有试剂未加 检查是否加了所有的所需试剂。 引物的降解 通过PAGE电泳检测引物完整性。 退火温度不正确 优化退火温度。 无扩增曲线但有扩增产物（凝胶电泳） qPCR仪设置不正确 检查dye selction，reference dye是否选择正确 失效的荧光检测 荧光检测应在PCR循环的退火/延伸阶段。 荧光PCR仪问题 参考qPCR仪器说明书 阴性对照（NTC）有扩增曲线   反应体系中有污染 qPCR片段较小，极易造成环境中气溶胶污染。如果融解曲线分析，解链温度和目的片段相同，凝胶电泳中NTC中的片段大小和目的片段相同，极有可能是反应体系中某一或某些试剂污染所引起的。建议换至没有污染源的环境进行PCR体系的配制。 引物二聚体 进行溶解曲线分析，如果扩增曲线的解链温度小于80℃，凝胶电泳片段大小和目的片度不符。请重新设计引物。 提高退火温度3℃。 PCR效率高于110% (斜率>-3.1） 有非特异性扩增 溶解曲线分析非特异性扩增；优化引物设计 PCR扩增效率低于90% (斜率<-3.6) 反应体系中有PCR反应抑制剂 更换或纯化模板DNA PCR扩增条件不合适引起扩增效率降低。 确认引物浓度。注意qPCR Master Mix是否失效。 引物设计 重新设计引物，避免扩增区域的DNA二级结构。 实时荧光曲线线性不好 模板DNA含量较低或过高 应调整样品的DNA浓度。 模板DNA中含有抑制PCR扩增反应的物质 对模板DNA进行纯化或更换模板。     质量不好的逆转录试剂盒合成的cDNA，逆转录反应液中所含的物质可能抑制PCR反应。 请降低样品浓度，或将样品纯化后再进行反应。建议使用品牌质量较好的cDNA合成逆转录试剂盒。 CT值高于预期值 加入的模板量太少 适当增加模板量。 样品被降解 检查样品的完整性。 引物不合适 重新设计合成引物。 CT值低于预期值 加入了过多的模板 减少模板量。 PCR产物太长 一般采用100-150bp的产物长度，一般不超过500bp CT值的标准差>0.16 取样不准确 每种样品的反应混合液单独配制，充分混匀； qPCR之前要离心，管壁不要沾有反应液。 ΔRn值太小 PCR效率太低 优化PCR反应条件。 目标模板数太低 增加模板量。 扩增曲线的荧光信号弱，或扩增曲线呈锯齿状   PCR的延伸时间过短即荧光读取时间不充分，荧光收集不能充分完成。 适当增加延伸时间。 以少于PCR仪器标准条件的反应体积进行扩增，荧光收集量的误差会增大 应增加反应体积以满足PCR仪器标准。

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