T4连接酶 T4 DNA ligase 货号：RTT2101 产品组成： 名称 规格 T4 DNA ligase (5U/μl) 100 U (20μl) 10×T4 DNA Ligation Buffer 0.2 ml 50%PEG Solution 0.15 ml 保存：-20℃ 产品简介： T4 DNALigase 是从表达T4DNA Ligase 基因的大肠杆菌经诱导表达后分离纯化而来的，催化相邻DNA链的5’磷酸基团和3’羟基基团以磷酸二酯键结合反应。该酶可催化平末端或粘性末端DNA之间的连接，还可修复双链DNA、RNA、DNA/RNA杂交双链中的单链切口。本品可应用于DNA插入片段和载体DNA的粘性末端和平末端的连接，以及线性DNA的自身环化。 活性定义：此酶的活力单位为Weiss Unit。1个WeissUnit相当于约200个粘性末端连接单位（cohesive-endligation unit, CEU）。1个CEU单位定义为在20 μl的连接反应体系中，在16℃30分钟内，能使50%的经HindIII消化的λDNA片段连接所需的酶量。 注意事项 1．T4DNA Ligase的最终用量不要超过推荐的用量，否则影响连接效率。 2．PEG可以极大提高平末端的连接效率，我们推荐加入终浓度为5%PEG Solution以提高平末端的连接效率。 3．为了提高转化效率，转化时建议所加入连接产物的量不要超过感受态细胞体积的10%。 4．由于T4DNA Ligase中含有甘油，比较粘稠容易挂壁，建议使用前短暂离心将液体收集到管底，取样时枪头尽量不要深入液面太深以免粘在枪头上造成损失。 使用方法： 一DNA片段和载体DNA的连接 1）粘性末端的连接 1．反应体系: 10μl体系 终浓度 线性载体DNA x μl 10-50 ng 插入DNA片段 y μl 插入片段：载体=1:1-5:1* 10×ligation buffer 1 μl 1× T4 DNA ligase(5U/μl) 0.1 μl 0.5 U ddH2O up to 10 μl *：载体与插入片段的摩尔数比需要优化：一般vector:insert在1:1~1:5之间均可得到较好的结果。用以下公式计算片段摩尔数：pmol数= DNA量(ng)/(660×片段bp数)×1000。例如：插入片段2000bp，线性载体为3000bp，如果载体使用量为50ng（0.025pmol），10μl连接体系中vector:insert的摩尔比是1:3，则需要2000bp pmol数为0.075pmol，插入片段2000bp的使用量为100ng。 2．彻底轻柔混匀后，瞬间离心，将管壁上的溶液收集到管底。 3．反应条件：16℃孵育30分钟。 4．可取5μl连接产物热击转化50μl感受态细胞或取1-2μl连接产物电击转化50μl感受态细胞。 注：1）若要提高电转实验效率，推荐65℃孵育10分钟或70℃孵育5分钟以灭活T4 DNA Ligase后，用DNA产物纯化试剂盒对连接后的DNA片段进行纯化后进行电击转化。 2）若要提高转化子数目，可将连接时间延长至1小时。 3）在10μl连接体系中若T4连接酶的终浓度大于1U，必须对连接后的DNA片段进行纯化后方可进行电转。 2）平末端的连接 1．反应体系: 10μl体系 终浓度 线性平末端载体DNA* x μl 10-50 ng 插入DNA片段 y μl 插入片段：载体=1:1-5:1** 10×ligation buffer 1 μl 1× T4 DNA ligase(5U/μl) 0.5 μl 2.5 U 50% PEG solution 1 μl 5% ddH2O up to 10 μl *：平滑末端的载体与 DNA 片段进行连接时，应首先将载体进行去磷酸化处理，以防止其自身环化。 **：载体与插入片段的摩尔数比需要优化：一般vector:insert在1:1~1:5之间均可得到较好的结果。用以下公式计算片段摩尔数：pmol数= DNA量(ng)/(660×片段bp数)×1000。例如：插入片段2000bp，线性载体为3000bp，如果载体使用量为50ng（0.025pmol），10μl连接体系中vector:insert的摩尔比是1:3，则需要2000bp pmol数为0.075pmol，插入片段2000bp的使用量为100ng。 2．彻底轻柔混匀后，瞬间离心，将管壁上的溶液收集到管底。 3．反应条件：16℃孵育30分钟。 4．可取5μl连接产物热击转化50μl感受态细胞或取1-2μl连接产物电击转化50μl感受态细胞。 注：1）由于平末端连接体系中，T4 ligase用量较大，若要提高电转实验效率，推荐65℃孵育10分钟或70℃孵育5分钟以灭活T4DNA Ligase后，用DNA产物纯化试剂盒或氯仿抽提对连接后的DNA片段进行纯化后才能进行电击转化。 2）若要提高转化子数目，可将连接时间延长至1小时。 二 线性DNA的自身环化 1．反应体系: 50μl体系 终浓度 线性载体DNA x μl 10-50 ng 10×ligation buffer 5 μl 1× T4 DNA ligase(5U/μl) 1 μl 5 U ddH2O up to 50 μl 2．彻底轻柔混匀后，瞬间离心，将管壁上的溶液收集到管底。 3．反应条件：16℃孵育30分钟。 4．可取5μl连接产物热击转化50μl感受态细胞或取1-2μl连接产物电击转化50μl感受态细胞。 注：1）若要提高电转实验效率，推荐65℃孵育10分钟或70℃孵育5分钟灭活T4 DNA Ligase后，用DNA产物纯化试剂盒或氯仿抽提对连接后的DNA片段进行纯化后才能进行电击转化。 三 接头连接 1．反应体系: 20μl体系 终浓度 线性DNA x μl 100-500 ng 磷酸化接头 y μl 1-2 μg 10×ligation buffer 2 μl 1× 50% PEG solution 2 μl 5% T4 DNA ligase(5U/μl) 0.4 μl 2 U ddH2O up to 20 μl 2．彻底轻柔混匀后，瞬间离心，将管壁上的溶液收集到管底。 3．反应条件：16℃孵育30分钟。 4．65℃孵育10分钟或70℃孵育5分钟灭活T4DNA Ligase。连接产物可以直接进行限制性内切酶酶切反应。
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