快速蛋白高灵敏度染色试剂盒 产品编号 规格 贮存 RTD6401 25次 常温
储存条件 常温保存，开封后一年有效。
产品简介 快速蛋白高灵敏度试剂盒是一种快速简单、可用于SDS-PAGE或非变性PAGE等蛋白分离后染色的试剂盒。本试剂盒也可以用于2D凝胶的染色，并且染色后兼容后续的质谱检测。本试剂盒只需约90分钟内可以完成凝胶的染色。对于BSA蛋白，检测灵敏度可以达到0.3 ng蛋白。 本试剂盒可足够用于25块常规的8×10 cm凝胶的染色。 说明书后附有实验记录表格，方便记录实验步骤。
产品组成： 产品编号 产品名称 规格 贮存 RTD6401-1 增敏液(100×) 26 ml 常温 RTD6401-2 染色溶液(100×) 26 ml 常温，避光 RTD6401-3 基本显色液(10×) 250 ml 4℃ RTD6401-4 显色加速液(2000×) 1.5 ml 常温，避光 RTD6401-5 终止液(20×) 125 ml 常温
注意事项： 1. 由于该方法染色非常灵敏，操作时请注意尽量使用高纯度的水，并确保所使用的器皿非常清洁，最好使用洁净的玻璃器皿。操作时必须戴手套，避免皮肤和凝胶直接接触。 2. 需自备乙醇、冰醋酸及MilliQ级纯水或双蒸水。 3. 下述使用说明中各种溶液的使用量适用于大小为8×10cm厚度为0.75-1 mm的凝胶。对于更大的凝胶，各种溶液的使用量需按凝胶面积的比例放大；对于更厚的凝胶，作用时间需按照厚度的比例适当延长10-20分钟。 4. 本说明书所指的常温温为20-25℃，操作温度较低时由于溶液的扩散能力下降，各步骤需适当延长时间。 5. 基本显色液(10×)在4℃低温贮存时可能会出现沉淀，可在37℃水浴中溶解，并充分混匀后使用。
使用方法： 一. 固定步骤： 1.1 电泳结束后，取凝胶放入约100 ml固定液中，在摇床上室温摇动20分钟，摇动速度为60-70 rpm。固定40分钟以上甚至过夜可以进一步降低背景。 固定液的配制 配制量100 ml 无水乙醇 冰醋酸 超纯水 50 ml 10 ml 40 ml 1.230%乙醇洗涤： 弃固定液，加入100 ml 30%乙醇，在摇床上室温摇动10分钟，摇动速度为60-70 rpm。 30%乙醇的配制： 70 ml MilliQ级纯水或双蒸水中加入30 ml乙醇，混匀后即成100 ml 30%乙醇。 1.3 水漂洗： 弃30%乙醇，加入200 ml MilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动10分钟，摇动速度为60-70 rpm。 二. 增敏步骤： 2.1 弃水，加入100 ml增敏液(1×)，在摇床上室温摇动2分钟，摇动速度为60-70 rpm。 增敏液(1×)的配制： 99 mlMilliQ级纯水或双蒸水中加入1ml增敏液(100×)，混匀后即为增敏液(1X)。增敏液(1×)配制后需在2小时内使用。 2.2 水漂洗(共2次)： 弃原有溶液，加入200 ml MilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动1分钟，摇动速度为60-70 rpm。 重复此步骤一次。 三. 染色步骤： 3.1 染色： 弃水，加入100 ml染色溶液(1×)，在摇床上室温摇动10分钟，摇动速度为60-70 rpm。 染色溶液(1X)的配制： 99 mlMilliQ级纯水或双蒸水中加入1 ml染色溶液(100X)，混匀后即为染色溶液(1X)。染色溶液(1X)配制后需在2小时内使用。 3.2 水洗涤： 弃染色溶液，加入100 ml MilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动1-1.5分钟，摇动速度为60-70rpm。 注意：水洗涤的时间不能超过1.5分钟。 四. 显色步骤： 弃水，加入100 ml显色液，在摇床上室温摇动3-7分钟，直至出现比较理想的预期蛋白条带，摇动速度为60-70 rpm。 显色液的配制 配制量100 ml 基本显色液(10×) 超纯水 显色加速液(2000×) 10 ml 90 ml 0.05 ml 注：显色加速液(2000×)有刺激性气味，建议在通风橱内操作； 显色液配制后需在20分钟内使用。 五. 终止步骤： 5.1 终止染色： 弃显色液，加入100 ml终止液(1×)，在摇床上室温摇动10分钟，摇动速度为60-70 rpm。终止时有气体产生属正常现象，产生的气体为二氧化碳。 终止液(1×)的配制： 95 mlMilliQ级纯水或双蒸水中加入5 ml终止液(20×),混匀后即为终止液(1X)。终止液(1X)配制后宜当天使用。 5.2 水洗涤： 弃终止液，加入100 ml MilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动5分钟，摇动速度为60-70 rpm。 六. 保存： 可在MilliQ级纯水或双蒸水中保存。或采用适当的方式制备成干胶。
常见问题： 一.  背景太深： 1.1. 显色时间过长。通常显色反应会在10分钟内结束，显色反应时间过长会导致背景很深。 1.2. 洗涤不充分。洗涤时间过短，或洗涤液加入的量不足，或者容器过于狭小导致摇动时溶液不易充分混合，或摇动速度过慢，导致混匀不充分。请按照说明书的建议确保各种溶液的用量和作用时间，摇床的推荐速度为60-70 rpm。 1.3 凝胶中原有的缓冲液等未在固定步骤中去除干净。一方面需确保固定的时间和固定液的用量，另一方面对于不是最常用的Bis-Tris缓冲的凝胶需要更长的固定时间以充分去除凝胶中的原有缓冲成分，以降低背景。 1.4水的纯度太低。需使用大于16 MΩ·cm的高纯度水。 二.  蛋白条带非常浅： 2.1 蛋白的半胱氨酸(Cysteine)残基的含量特别低或几乎没有。半胱氨酸残基的存在对于染色非常重要，半胱氨酸残基的含量过低会导致检测灵敏度下降。 2.2 染色后水洗涤时间过长。在染色溶液染色时需严格控制水洗涤的时间，水洗涤的时间不能超过1.5分钟，否则会导致过多的显色离子被洗去，导致检测灵敏度下降。 2.3 上样量不足。本试剂盒检测BSA的灵敏度可以达到0.3ng，对于不同的蛋白检测灵敏度可能不同。对于一些蛋白可能需要大于1 ng的蛋白量才能被检测到。 2.4 固定步骤后的洗涤不够充分。导致少量乙酸残留，影响后续检测。确保30%乙醇洗涤和水洗涤的用量和时间，可以适当延长洗涤时间。 三.  凝胶上出现小点或其它非蛋白的痕迹： 3.1 凝胶没有充分被溶液浸没。请注意选择大小合适的容器，并加入足量的各种溶液，同时需保持适当的混匀速度确保凝胶可以被溶液浸没。 3.2 用于染色的容器没有充分洗涤干净。容器需先用洗涤剂充分洗涤，随后用自来水充分冲洗，最后用高纯度水再洗涤数次。该容器最好能专用于染色，并注意避免各种可能的蛋白污染。 3.3 指纹或其它压痕。请注意戴手套操作，切勿直接接触皮肤。操作时请注意尽量勿挤压、折叠或摩擦凝胶。 3.4 有金属物质接触凝胶。金属物质例如金属镊子等接触凝胶会出现非特异性痕迹。 四.  在60-70 kD处出现一片模糊的蛋白染色背景： 皮肤上脱落的角蛋白(keratin)污染了蛋白样品。一方面需注意戴手套操作，另一方面需注意盛放蛋白样品的容器盖子尽量不要敞开，甚至在取放蛋白样品时在超净台内进行以避免可能的角蛋白污染。 五. 在凝胶的顶端处出现黄色背景： 5.1 样品中DTT浓度很高。采用其它适当的还原试剂，或者在许可范围内适当减少DTT 的用量。 5.2 采用Tris-Glycine-SDS电泳体系。Tris-Glycine-SDS电泳体系中的Glycine会导致 背景凝胶的顶端出现轻微的黄色背景。 六. 染色离子在染色器皿中出现沉淀：    染色器皿中可能含有残余的洗涤剂或上次染色时的残余试剂。需确保把染色器皿洗涤干净。  
实验记录表格 实验日期：     约80分钟 标记√ 起始时间 一 固定步骤           固定 20 min       乙醇漂洗 10 min       水漂洗 10 min     二 增敏步骤           增敏 2 min       水漂洗 1 min       水漂洗 1 min     三 染色步骤           染色 10 min       水漂洗 ＜1.5 min     四 显色步骤 显色 3-7 min     五 终止步骤           终止 10 min       水漂洗 5 min     六 保存          实验示例：

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