碱性蛋白非变性PAGE凝胶制备及电泳试剂盒（货号:RTD6131） Basic Protein Native PAGEGel Preparation and Electrophoresis Kit 产品组成： 货号 名称 规格 保存条件 AC2913-01 30%PAA(29:1) 100 ml 4℃，避光 RTD6131-02 4×碱性蛋白分离胶缓冲液 pH4.3 100 ml 4℃ RTD6131-03 4×碱性蛋白浓缩胶缓冲液 pH6.8 50 ml 4℃ RTD6131-04 100×分离胶促凝剂 2.5 ml -20℃ AP020P APS（干粉） 0.5 g RT TA0761-01 TEMED 0.5 ml 4℃，避光 PL110 5×甲基绿上样缓冲液 1 ml -20℃ TG160P 5×碱性蛋白电泳缓冲液（干粉） 1 L RT 产品简介： 本公司提供的试剂盒包含碱性蛋白凝胶制备及电泳所需的全部试剂，用户只需自备制胶器具和蒸馏水。本试剂盒可用于配制碱性蛋白非变性(native)PAGE凝胶。本试剂盒可配制30-50块常规大小的非变性PAGE胶。 各种蛋白质分子由于所含的碱性氨基酸和酸性氨基酸的数目不同，因而有各自的等电点。凡碱性氨基酸含量较多的蛋白质称为碱性蛋白质，等电点偏碱性，如组蛋白、精蛋白等。反之，凡酸性氨基酸含量较多的蛋白质，等电点就偏酸性。分离碱性蛋白时候，要利用低 pH 凝胶系统，分离酸性蛋白时候，要利用高 pH 凝胶系统。酸性蛋白通常在非变性凝胶电泳中采用的 pH 是 8.8的缓冲系统，蛋白会带负电荷，蛋白会相阳极移动；而碱性蛋白通常电泳是在微酸性环境下进行，蛋白带正电荷，这时候需要将阴极和阳极倒置才可以电泳。 特别说明：由于本系统采用非连续凝胶系统，分离胶pH为4.3，因此要求待分离的蛋白等电点pI＞7.0，这样碱性蛋白在酸性凝胶系统内带正电荷，在凝胶电泳中才能正常向阴极泳动。如果待分离的蛋白等电点pI＜7.0，请选择非连续Laemmli活性凝胶系统分离（货号：RTD6130）。 使用说明： 一 配制分离胶 根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度（表一），配制非变性PAGE的分离胶。 表一 不同浓度的PAGE分离胶的最佳分离范围 PAGE分离胶浓度 最佳分离范围 6% 50-150kD 8% 30-90kD 10% 20-80kD 12% 12-60kD 15% 10-40kD 配制分离胶前，根据以下配方准备10% APS： 10% APS配制-5 ml： 将0.5 gAPS干粉溶于5 ml灭菌水中，彻底溶解后分装，1 ml/支，-20℃备存，每次取一管使用。10% APS应尽量减少室温存放时间，以防失效。10%APS在4℃有效期为一周，-20℃有效期6个月。若发现凝胶聚合时间延长，应考虑更换使用-20度保存的10% APS。 制备分离胶步骤： 1．参照凝胶模具说明书，装配好凝胶模具。 2．根据下表，将不同体积的成分在小烧杯或试管中混合，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡 3．在凝胶模具中灌入适量分离胶溶液（对于mini-gel，凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5 cm或距梳齿约0.5 cm即可），然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层1-5 cm的水层，使凝胶表面保持平整。 4．静置15-30分钟，待分离胶和水层之间出现一个清晰的界面后，说明凝胶已聚合。 注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。可以根据环境温度的不同调节APS的加入量。 二 浓缩胶制备： 1．去除覆盖在分离胶上的水层。 2．按照表一将不同成分在一个小烧杯或试管中混合，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。 3．将浓缩胶溶液加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。 4．将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。 5．静置30-60分钟，等待浓缩胶聚合。 注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。可以根据环境温度的不同调节APS的加入量。 三 电泳： 凝胶凝固好后，根据以下配方准备电泳缓冲液。 5×碱性蛋白电泳缓冲液的配制-1 L：将5×碱性蛋白电泳缓冲液干粉全部倒入1L烧杯中，加入约900 ml水彻底溶解，加入冰醋酸11ml，用水定容至1 L，即配成5×碱性蛋白电泳缓冲液（此溶液pH值约为4.4）。 将5×碱性蛋白电泳缓冲液稀释5倍即配成1×碱性蛋白电泳缓冲液。在电泳槽的内槽内加入1×碱性蛋白电泳缓冲液(让电泳缓冲液漫过加样孔)，轻轻的拨出梳子，冲洗加样孔，随后在电泳槽外槽加入适量的1×碱性蛋白电泳缓冲液。上样，把电泳电源的电源线互换，即红色的阳极电极查到阴极孔，黑色的阴极电极插到阳极孔，按照表四条件，电泳，等指示前沿甲基绿电泳到分离胶下缘后，结束电泳，染色或者进行下一步实验。 表四 碱性蛋白电泳条件 恒电压 150V 起始电流 30-40mA/板胶 结束电流 10-20mA/板胶 电泳时间 40-45分钟 实验示例： RTD6128 碱性蛋白非变性电泳蛋白Marker PL110 5×甲基绿碱性蛋白上样缓冲液 TG160P 5×碱性蛋白电泳缓冲液（非变性电泳）
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