RIPA裂解液(强) 产品包装： 产品编号 产品名称 产品包装 说明书 RL1020 RIPA裂解液(强) 100 ml 1份 产品简介： RIPA裂解液(RIPALysis Buffer)是一种传统的细胞组织快速裂解液。RIPA裂解液裂解得到的蛋白样品可以用于常规的Western、IP等。RIPA的本意是Radio Immunoprecipitation Assay。RIPA裂解液的配方有很多种，根据其裂解液的强度大致可以分为强、中、弱三类。RIPA裂解液(强)的主要成分为50 mM Tris (pH 7.4)，150 mM NaCl，1% TritonX-100，1%sodium deoxycholate，0.1% SDS，以及sodium orthovanadate，sodiumfluoride，EDTA，EGTA等多种抑制剂。可以有效抑制蛋白降解。由于含有较高浓度的Triton X-100等干扰物质，不能用传统Bradford法测定由本裂解液裂解得到样品的蛋白浓度，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒（货号：RTP7102）或Bradford蛋白浓度测定试剂盒（去垢剂兼容型）（货号：RTP7104）测定蛋白浓度。 保存条件： -20℃保存，一年有效。 注意事项： 1.为取得最佳的使用效果，尽量避免过多的反复冻融。可以适当分装后使用。需自备PMSF。裂解样品的所有步骤都需在冰上或4℃进行。 2. RIPA裂解液的裂解产物中经常会出现一小团透明胶状物，属正常现象。该透明胶状物为含有基因组DNA等的复合物。在不检测与基因组DNA结合特别紧密的蛋白的情况下，可以直接离心取上清用于后续实验；如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白，则可以通过超声处理打碎打散该透明胶状物，随后离心取上清用于后续实验。如果检测一些常见的转录因子，例如NF-kappaB、p53等时，通常不必进行超声处理，就可以检测到这些转录因子。 使用说明： 1. 准备RIPA裂解液： 融解RIPA裂解液，混匀；取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入1/100体积的100 mM PMSF，使PMSF的最终浓度为1 mM。 2. 细胞蛋白提取： 2.1 贴壁细胞：去除培养液，加入适量1×PBS，轻柔漂洗一遍，不要扰动贴壁细胞。按照6孔板每孔加入100-200 μl裂解液的比例加入裂解液，移液器吹打数下，使裂解液和细胞充分接触，冰上裂解细胞5分钟，用细胞刮刀刮下细胞收集于1.5 ml离心管中，冰上继续裂解15分钟，间歇混匀。 培养板规格/培养皿表面积 细胞量 RIPA推荐使用量 100 mm培养皿 1.5×107 0.5-1 ml 60 mm培养皿 5×106 0.25-0.5 ml 35 mm培养皿 2×106 0.2-0.4 ml 6孔板 2.5×106 100-200 μl 24孔板 5×105 100-150 μl 96孔板 1×105 50-100 μl 2.2 悬浮细胞：450 g4℃ 离心5 min收集细胞；用适量1×PBS重悬细胞，450 g 4℃ 离心5 min收集细胞；重复漂洗细胞一次；按照细胞沉淀体积（PCM）20 μl加入200 μl RIPA的比例加入RIPA，混匀细胞沉淀，冰浴处理15分钟，间歇混匀。 注：2×106 Jurkat细胞，其细胞沉淀体积（PCM，Packed Cell Volume）大约为20 μl。 2.3 裂解细胞： 裂解混合物超声波处理（超声条件根据仪器调整，建议条件为）；如没有超声破碎仪，可以使用注射器用27G针头处理裂解物10-15次（货号：PE2719 ，蛋白提取针头套装），以彻底裂解细胞。冰浴处理15分钟。 注：裂解中细胞会释放出变性的核酸，呈团状粘稠透明样，如不进行超声或针头裂解处理，会导致裂解物非常粘稠，大大降低蛋白提取的得率和纯度。 2.4 离心收集上清： 充分裂解后，4℃ 16000g离心10分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。 3. 组织样品蛋白提取： 3.1 手术切除的组织块迅速置于预冷的生理盐水中，漂洗数次，洗净组织血迹，用滤纸吸 干组织表面液体，将组织切成细小的碎片。 3.2 按照每20 mg组织加入200 μl裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。) 3.3 用玻璃匀浆器冰浴匀浆5-10次，收集匀浆后的裂解混合物，超声波处理（超声条件根据仪器调整，建议条件为）；如没有超声破碎仪，可以使用注射器用27G针头处理裂解物10-15次（货号：PE2719 ，蛋白提取针头套装），以彻底裂解细胞。裂解物冰浴处理15分钟。 注：裂解中细胞会释放出变性的核酸，呈团状粘稠透明样，如不进行超声或针头裂解处理，会导致裂解物非常粘稠，大大降低蛋白提取的得率和纯度。 3.4 充分裂解后，4℃ 16000g离心10分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。 实验示例： Jurkat RIPA总蛋白提取，GAPDH检测 总蛋白提取：4×106 Jurkat细胞，450 g 离心收集，去上清，PBS漂洗两次，沉淀中加入200 μl RIPA（加2 μl 100 mM PMSF），冰上裂解5分钟，4℃ 16000 g 15 分钟，上清即为总蛋白（TP）。 电泳：RTD6132-15%3.3C 200 V 33-12 mA 55 min 转膜：NC膜，1×RealBlot快速转膜液湿转，稳流400 mA，电压变化64-57 V，转膜时间35 min 封闭：无蛋白快速封闭液，RT 20 min 一抗孵育：GAPDH 羊抗兔多抗，一抗稀释液稀释1：2000 二抗孵育：羊抗兔IgG-HRP，二抗稀释液稀释1：5000 检测：ECL发光检测 实验示例：
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