Hochest 33342活细胞染色液（100×） Hoechst 33342 StainingSolution for Live Cells(100×) 产品组成： 货号 名称 规格 HE1014S Hochest 33342活细胞染色液（100×） 0.5 ml 说明书 一份 产品简介： Hoechst 33342，也称bisBenzimideH 33342 或HOE 33342，分子式为C27H28N6O·3HCl，分子量MW561.93，CAS:23491-52-3，是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，对细胞的毒性较低。Hoechst33342 专一性地与双链DNA结合（优先结合AT），常用于细胞核染色。染色后可以用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。Hoechst 33342 的最大激发波长为346 nm（紫外激发），最大发射波长为460nm（蓝色荧光）；Hoechst 33342 和双链DNA 结合后，最大激发波长为350nm，最大发射波长为461nm。另外，由于Hoechst 33342专一性结合DNA，不与RNA结合，样品无需使用RNase处理。与DAPI相比，Hoechst33342具有更好的膜通透性，更适合于活细胞的染色。 Hoechst 33342和Hoechst33258相比，Hoechst 33342对细胞的毒性作用更小一些，33258穿透能力较33342弱，染活细胞时容易被"泵出"，也就是拒染。所以一般来说Hoechst 33258用于细胞固定后再染色，而Hoechst33342则可以对活细胞直接进行染色。 本染色液为100×浓度，使用终浓度为1×，可直接用于活细胞或组织的细胞核染色，也可稀释后用于固定细胞或组织的细胞核染色。 贮存： -20℃避光保存，一年有效。 操作步骤： 一. 活细胞染色： 1.1 贴壁细胞： 1.1.1在培养液中均匀滴加适量的Hoechst 33342活细胞染色液(100×)至终浓度为1×，轻柔混匀。例如对于十二孔板中培养的贴壁细胞，每孔有1 ml的培养液，每孔需要加入10 μl Hoechst 33342活细胞染色液(100×)。培养液中的血清、酚红等都不会对染色产生干扰。 1.1.2在适宜于细胞培养的温度孵育10分钟，可以直接在荧光显微镜下观察。如果考虑到培养液对观察效果的影响，进行以下操作步骤。 1.1.3吸除含染料的培养液，用PBS洗涤2-3次即可在荧光显微镜下观察。 注：为避免凋亡细胞随培养液或PBS被吸除，在吸除液体前，对于用多孔板中培养的细胞，最好用多孔板离心机离心一下以充分沉淀那些已经漂浮起来的凋亡细胞。细胞发生凋亡时，会看到凋亡细胞的细胞核呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染。 1.2. 悬浮细胞： 1.2.1 在悬浮细胞培养液中加入适量的Hoechst 33342活细胞染色液(100×)至终浓度为1×，轻柔混匀。例如对于12孔板中培养的贴壁细胞，每孔有1 ml的培养液，每孔需要加入10 μl Hoechst 33342活细胞染色液(100×)。培养液中的血清、酚红等都不会对染色产生干扰。 1.2.2 在适宜于细胞培养的温度孵育10分钟，可以直接在荧光显微镜下观察。如果考虑到培养液对观察效果的影响，进行以下操作步骤。 1.2.3将细胞转移到1.5 ml离心管中，500 g 离心5分钟收集细胞。细胞沉淀用PBS洗两遍，每次3分钟，吸尽液体。 1.2.4细胞沉淀中加入100-200 μl PBS，重悬沉淀。 1.2.6取5μl抗荧光淬灭封片液于载玻片上，加入等体积步骤1.2.4染色后细胞重悬液，盖上一洁净的盖玻片，尽量避免气泡。 1.2.6 荧光显微镜使用紫外激发，可检测到呈蓝色的细胞核。激发波长350nm左右，发射波长460nm左右。 注：荧光染料都存在淬灭的问题，建议染色后尽快检测。 二. 实验示例: 染色程序： Jurkat细胞密度调整到1×106/ml，六孔板接种2 ml，加入10 μl STS（星孢菌素）至终浓度1 μM 37度培养3小时；加入20 μl Hochest 33342活细胞染色液（100×），RT避光染色15分钟，荧光显微镜直接观察。左图为正常细胞（10×），右图为STS诱导凋亡的细胞（10×）。 染色程序： 左为明场 20×相差；右为紫外激发 293细胞消化后调整密度为1×105/ml；12孔板，每孔接种1 ml，37度培养30小时；加入10 μl Hochest 33342活细胞染色液（100×）；37度培养10分钟，直接观察。
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