产品编号：R201062 包装规格：50 次/100 次 试剂盒组成
组分	50 次	100 次	储存条件
Lysis Buffer	25ml	50ml	4-10℃
Reaction Buffer	200μl	400μl	-20℃
PCR Mix 1	1.5ml	3ml	-20℃,避光
PCR Mix 2	1.5ml	3ml	-20℃,避光
Elution Buffer	1ml	2ml	-20℃
操作手册	1 份	1 份

 

产品介绍

本试剂盒是根据中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所官方公布的新型冠状病毒核酸检测引物和探针序列（Specific primers and probes for detection 2019 novel coronavirus）以及WHO官方推荐检测标准设计，使用荧光定量PCR检测病毒开放读码框1ab和核壳蛋白（nucleoprotein，N）。

检测前准备

1. 自备试剂：无水乙醇，提前冷冻24h;
2. 自备耗材：不含RNase 的吸头，不含RNase的EP管，PCR管等；
3. 自备仪器：水浴锅，荧光定量PCR仪。

操作步骤

1 待检测样品制备（如果没有核酸提取仪或核酸提取试剂盒请执行这一步）

1.1 样品：咽拭子、鼻拭子或痰液，最好是下呼吸道样品（注意样品体积最好为40μl），加入到1.5ml EP管中，加入480μl Lysis buffer，用吸头（不含RNase）充分混匀。用手剧烈震荡后，室温放置5min，4-10℃,12000rpm离心15min；
1.2 用吸头（不含RNase）取上层水相（大约有200μl左右）转移至EP管（不含RNase）中，直接倒入冷的无水乙醇至1.5ml刻度位置，冷冻静置30min，4-10℃,12000rpm离心10min,可见底部有微量沉淀。
1.3 去上清，常温放置10min干燥沉淀，加入Elution Buffer 10μl，用枪头反复吹打几次底部，55-60℃温育10min后，12000rpm离心1min即为待检测样品，-20℃备用或直接进行下面步骤。

2 核酸检测

2.1 参考如下表格中配置的20μl反应体系：

待检测样品	5μl
Elution Buffer	11μl
混匀后离心把液体沉降至管底，65℃孵育5min，随后立即置于冰上冷却。
Reaction Buffer	4μl
总体积	20μl

2.2 用手指轻弹PCR管混匀或用涡旋混合器在最低速度轻轻混匀，随后离心沉淀液体。
2.3 42℃孵育60 min。
2.4 80℃孵育10 min终止反应，12000rpm离心1min，即为RT-PCR模板。
2.5 参考如下表格中配置的25μl反转录体系（所有步骤都在冰浴上操作，可以使用常规吸头和PCR管）
开放读码框1ab（ORF1ab）检测

PCR Mix 1	15μl
RT-PCR模板	4μl
Elution Buffer	6μl
Total	25μl

    
核壳蛋白（nucleoprotein，N）检测

PCR Mix 2	15μl
RT-PCR模板	4μl
Elution Buffer	6μl
Total	25μl

 
2.6用手指轻弹PCR管混匀或用涡旋混合器在最低速度轻轻混匀，随后离心沉淀液体。
2.7 按照如下表格步骤进行RT-PCR：

Temperature(℃)	Time(minute:second)	No. of cycle
50 95	5:00 0:20	1
95 60	0:05 0:30	40

 
2.8 根据荧光定量PCR仪读取Ct值。 阴性:无Ct值或Ct为40。
阳性：Ct值<37，可报告为阳性。
可疑：Ct值在37-40之间，建议重复实验，若重做结果Ct值<40，扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性,否则为阴性。 如果检测单位配有核酸提取仪或购买了RNA提取试剂盒，可以使用核酸提取仪或RNA提取试剂盒提取RNA后，直接进行第二步核酸检测。