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2018年2月8日-2018年2月23日。

食品安全国家标准 食品微生物学检验 志贺氏菌检验(GB 4789—2012)

食品安全国家标准 食品微生物学检验 志贺氏菌检验(GB 4789—2012)

前言
本标准代替GB/T 4789.5-2003《食品卫生微生物学检验 志贺氏菌检验》。 
本标准与 GB/T 4789.5-2003 相比,主要变化如下: 
——修改了标准名称; 
——修改了培养基和试剂;
——修改了操作步骤中增菌部分和生化试验及附加生化试验部分;
——修改了表2
——修改了表4
 

食品安全国家标准
食品微生物学检验 志贺氏菌检验 
1 范围
本标准规定了食品中志贺氏菌(Shigella)的检验方法。
本标准适用于食品中志贺氏菌的检验。。
2 设备和材料 
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
a) 恒温培养箱:36 ℃ 1 ℃;
b) 冰箱:2 ℃~5 ℃; 
c) 膜过滤系统;
d) 厌氧培养装置:41.5 ℃?1 ℃; 
e) 电子天平:感量 0.1 g;
f) 显微镜:10 ~100 ; 
g) 均质器;
h) 振荡器;
i) 无菌吸管:1 mL(具 0.01 mL 刻度)、10 mL(具 0.1 mL 刻度)或微量移液器及吸头;
j) 无菌均质杯或无菌均质袋:容量 500 mL; 
k) 无菌培养皿:直径 90 mm; 
l) pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸; 
m) 全自动微生物生化鉴定系统。 
3? 培养基和试剂
3.1 志贺氏菌增菌肉汤-新生霉素:见附录 A 中 A.1。 
3.2? 麦康凯(MAC)琼脂:见附录 A中 A.2。 
3.3? 木糖赖氨酸脱氧胆酸盐(XLD)琼脂:见附录 A 中 A.3。
3.4? 志贺氏菌显色培养基。 
3.5 三糖铁(TSI)琼脂:见附录 A中 A.4。 
3.6? 营养琼脂斜面:见附录 A? 中 A.5。 
3.7 半固体琼脂:见附录 A 中 A.6。 
3.8 葡萄糖铵培养基:见附录 A中 A.7。 
3.9? 尿素琼脂:见附录 A中 A.8。
3.10? β-半乳糖苷酶培养基:见附录 A中 A.9。
3.11 氨基酸脱羧酶试验培养基:见附录 A中 A.10。
3.12 糖发酵管:见附录 A 中 A.11。
3.13 西蒙氏柠檬酸盐培养基:见附录 A中 A.12。 
3.14 粘液酸盐培养基:见附录 A 中 A. 13。 
3.15 蛋白胨水、靛基质试剂:见附录 A中 A.14。
3.16 志贺氏菌属诊断血清。 
3.17 生化鉴定试剂盒。 
4 检验程序 
志贺氏菌检验程序见图 1。 


5? 操作步骤
5.1 增菌 
以无菌操作取检样 25 g(mL),加入装有灭菌 225 mL 志贺氏菌增菌肉汤的均质杯,用旋转刀片式均 质器以 8 000 r/min~10 000 r/min 均质;或加入装有 225 mL 志贺氏菌增菌肉汤的均质袋中,用拍击式均质 器连续均质 1 min~2 min,液体样品振荡混匀即可。于 41.5 ℃±1℃,厌氧培养 16 h~20 h。 
5.2 分离
取增菌后的志贺氏增菌液分别划线接种于 XLD 琼脂平板和 MAC 琼脂平板或志贺氏菌显色培养基平板 上,于 36 ℃±1 ℃培养 20 h~24 h,观察各个平板上生长的菌落形态。宋内氏志贺氏菌的单个菌落直径大 于其他志贺氏菌。若出现的菌落不典型或菌落较小不易观察,则继续培养至 48 h 再进行观察。志贺氏菌在 不同选择性琼脂平板上的菌落特征见表 1。

5.3 初步生化试验
5.3.1自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落,分别接种TSI、半固体和营养琼脂斜面各一 管,置36 ℃±1 ℃培养20 h~24 h,分别观察结果。 
5.3.2 凡是三糖铁琼脂中斜面产碱、底层产酸(发酵葡萄糖,不发酵乳糖,蔗糖)、不产气(福氏志贺氏 菌6型可产生少量气体)、不产硫化氢、半固体管中无动力的菌株,挑取其5.3.1中已培养的营养琼脂斜面 上生长的菌苔,进行生化试验和血清学分型。 
5.4 生化试验及附加生化试验 
5.4.1 生化试验 
用 5.3.1 中已培养的营养琼脂斜面上生长的菌苔,进行生化试验,即 β-半乳糖苷酶、尿素、赖氨酸脱 羧酶、鸟氨酸脱羧酶以及水杨苷和七叶苷的分解试验。除宋内氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌 13 型的鸟氨酸 阳性;宋内氏菌和痢疾志贺氏菌 1 型,鲍氏志贺氏菌 13 型的 β-半乳糖苷酶为阳性以外,其余生化试验志贺 氏菌属的培养物均为阴性结果。另外由于福氏志贺氏菌 6 型的生化特性和痢疾志贺氏菌或鲍氏志贺氏菌相 似,必要时还需加做靛基质、甘露醇、棉子糖、甘油试验,也可做革兰氏染色检查和氧化酶试验,应为氧 化酶阴性的革兰氏阴性杆菌。生化反应不符合的菌株,即使能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集,仍不得 判定为志贺氏菌属。志贺氏菌属生化特性见表 2。

 

5.4.2 附加生化实验 
由于某些不活泼的大肠埃希氏菌(anaerogenic E.coli)、A-D(Alkalescens-D isparbiotypes 碱性-异型) 菌的部分生化特征与志贺氏菌相似,并能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集;因此前面生化实验符合志贺 氏菌属生化特性的培养物还需另加葡萄糖胺、西蒙氏柠檬酸盐、粘液酸盐试验(36 ℃培养 24 h~48 h)。志 贺氏菌属和不活泼大肠埃希氏菌、A-D 菌的生化特性区别见表 3。

5.4.3 如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统,可根据5.3.2的初步判断结果,用5.3.1中已培 养的营养琼脂斜面上生长的菌苔,使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。 
5.5 血清学鉴定 
5.5.1抗原的准备 
志贺氏菌属没有动力,所以没有鞭毛抗原。志贺氏菌属主要有菌体(O)抗原。菌体 O 抗原又可分为 型和群的特异性抗原。 
一般采用 1.2%~1.5%琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。 
注 1:一些志贺氏菌如果因为 K 抗原的存在而不出现凝集反应时,可挑取菌苔于 1 mL 生理盐水做成浓菌液,100 ℃煮 沸 15 min~60 min 去除 K 抗原后再检查。 
注 2:D 群志贺氏菌既可能是光滑型菌株也可能是粗糙型菌株,与其他志贺氏菌群抗原不存在交叉反应。与肠杆菌科不 同,宋内氏志贺氏菌粗糙型菌株不一定会自凝。宋内氏志贺氏菌没有 K 抗原。 
5.5.2 凝集反应 
在玻片上划出 2 个约 1cm×2cm 的区域,挑取一环待测菌,各放 1/2 环于玻片上的每一区域上部,在其 中一个区域下部加 1 滴抗血清,在另一区域下部加入 1 滴生理盐水,作为对照。再用无菌的接种环或针分 别将两个区域内的菌落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合 1 min,并对着黑色背景进行观察,如果抗血清 中出现凝结成块的颗粒,而且生理盐水中没有发生自凝现象,那么凝集反应为阳性。如果生理盐水中出现 凝集,视作为自凝。这时,应挑取同一培养基上的其他菌落继续进行试验。 
如果待测菌的生化特征符合志贺氏菌属生化特征,而其血清学试验为阴性的话,则按 5.5.1 注 1 进行 试验。 
5.5.3 血清学分型(选做项目) 
先用四种志贺氏菌多价血清检查,如果呈现凝集,则再用相应各群多价血清分别试验。先用 B 群福氏 志贺氏菌多价血清进行实验,如呈现凝集,再用其群和型因子血清分别检查。如果 B 群多价血清不凝集, 则用 D 群宋内氏志贺氏菌血清进行实验,如呈现凝集,则用其Ⅰ相和Ⅱ相血清检查;如果 B、D 群多价血 清都不凝集,则用 A 群痢疾志贺氏菌多价血清及 1~12 各型因子血清检查,如果上述三种多价血清都不凝 集,可用 C 群鲍氏志贺氏菌多价检查,并进一步用 1~18 各型因子血清检查。福氏志贺氏菌各型和亚型的 型抗原和群抗原鉴别见表 4。

5.6 结果报告 
综合以上生化试验和血清学鉴定的结果,报告 25 g(mL)样品中检出或未检出志贺氏菌。

 
总 公 司:上海瑞楚生物科技有限公司
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